Biomonitoring of microcystin and aflatoxin co-occurrence in aquaculture using immunohistochemistry and genotoxicity assays

This work investigated the effects of co-occurring aflatoxin B1 (AFB1) and microcystin (MC) in aquaculture, using immunohistochemistry and genotoxicity methods. Tilapia (Oreochromis niloticus) were exposed to AFB1 by intraperitoneal and MC (cell extract of Microcystis aeruginosa) by intraperitoneal and immersion routes. The interaction of MC-AFB1 was evaluated co-exposing the intraperitoneal doses. Blood samples were collected after 8, 24, and 48h to analyze the micronucleus frequency and comet score. The interaction of MC-AFB1 showed a synergic mutagenic response by higher micronucleus frequency of co-exposed group. A slight genotoxic synergism was also observed in the comet score. Immunohistochemistry detected MC in al lthe fish liver tissues exposed to MC by intraperitoneal route, and only the immersed group with the highest dose of MC showed a positive response. Although MC was non-detectable in the edible muscle, the combination of immunohistochemistry with genotoxicity assay was an attractive biomonitoring tool in aquaculture, where the animals were frequently exposed to co-occurring synergic hazards.

Imunoistoquímica: detecção de microcistina em tilápia exposta ao extrato de Microcystis aeruginosa (Cyanobacteria) / Imunohistochemistry: detection of microcystin in tilápia exposed to Microcystis aeruginosa (Cyanobacteria) extract

A deterioração da qualidade de água pela piscicultura associa-se à eutrofização, com florescimento de cianobactérias. Microcystis aeruginosa destaca-se como principal produtora de microcistinas (MCs), grupo de hepatotoxinas com potencial promotor de tumor. No presente trabalho desenvolveu-se método imunoistoquímico para a detecção de MC em tilápias (Oreochromis niloticus) submetidas à injeção intraperitoneal (i.p.) ou imersão em extrato de M. aeruginosa BCCBUSP 262, empregando anticorpo monoclonal anti-MC (M8H5) e sistema polímero-peroxidase. As tilápias (N=42) foram submetidas a sete tratamentos, sendo três grupos inoculados i.p. com 2,0x105, 4,0x105 e 1,0x106 cels.Kg-1 de M. aeruginosa BCCBUSP 262 e quatro submetidos à imersão em diferentes concentrações do extrato da cianobactéria (variando de 1,0x104 a 1,0x105cel.mL-1). Analisando fígado e tecido muscular pelo ensaio imunoistoquímico, não se detectou marcação em tecido muscular. Todos os animais inoculados i.p. apresentaram marcação positiva para MC no fígado, mas em teste de imersão, apenas os expostos a maior dose (1,0x105 cels.mL- 1) apresentaram marcação positiva. Embora MC não seja detectada em tecido muscular, assim como no fígado de animais imersos em extrato de M. aeruginosa CCBUSP 262 em concentrações menores que 1,0x105 cels.mL-1, os resultados constituíram-se base para o desenvolvimento metodológico objetivando a aplicação da imunoistoquímica no diagnóstico rápido no controle de qualidade de pescados.

The deterioration of the water quality due to aquaculture is associated with eutrophication, with bloom of cyanobacteria. Microcystis aeruginosa is distinguished as main producer of microcystins (MCs), group of hepatotoxins with tumor promoter potential. In the present work immunohistochemical method for detection of MC in tilápia (Oreochromis niloticus), fish submitted to intraperitoneal injection (i.p.) or immersion in extract of M. aeruginosa BCCBUSP 262 was developed, using monoclonal antibody anti- MC (M8H5) and polymer peroxidase system. The tilápias (N=42) had been submitted to the seven treatments, three groups inoculated i.p. with 2.0x105, 4.0x105 and 1.0x106 cells. Kg-1 of M. aeruginosa BCCBUSP 262 and four groups exposed to the immersion in different extract concentrations of cyanobacterium. Analyzing liver and muscular tissue for immunohistochemical assay, muscular tissue was not stained. All the animals inoculated i.p. presented positive marking for MC in the liver, but in immersion test, only the ones exposed in the highest dose (1,0x105 cels.mL-1) presented positive marking. Although MC was not detected in muscular tissue, as well as in the liver of animals immersed in extract of M. aeruginosa BCCBUSP 262 in concentrations less than 1.0x105 cels.mL-1, the results would constitute in the base for the methodological development aiming the application of the immunohistochemistry in the rapid diagnosis in quality control of fish.

Adiçäo de íon magnésio, potássio e vitaminas visando ao meio de cultura para a produçäo de enterotoxina estafilocócica A / Addition of magnesium, potassium ion and vitamins in culture media for staphylococcal enterotoxin A production

Staphylococcus aureus é um patógeno freqüentemente envolvido em surtos de intoxicaçäo alimentar. A detecçäo rápida e eficaz da toxina é fundamental para o diagnóstico e tratamento da doença. Com o objetivo de produzir enterotoxina estafilocócica A (EEA), destinada à produçäo de reagentes imunológicos, testaram-se 21 formulaçöes baseadas em hidrolisado de caseína (peptona, triptona e casitona) adicionadas de tiamina, niacina, Mg²+, K+ e/ou extrato de levedura. Os meios inoculados de S. aureus linhagem 722 foram incubados a 37ºC (220 rpm, 24 horas) e os sobrenadantes (10.000 g. 15 min a 4ºC) testados quanto à produçäo de EEA (RPLA, aglutinaçäo de látex) e exoproteínas totais (método de Bradford). A melhor produçäo de toxina (92,6 µg/mL de EEA) foi obtida no meio com triptona adicionada de tiamina e niacina, seguida de triptona adicionada de extrato de levedura e K+ (87 µg/mL). A combinaçäo tiamina + niacina + Mg²+ reduziu a produçäo de EEA, em relaçäo ao meio básico triptona ou peptona. O extrato de levedura com triptona aumentou a produçäo de EEA (59,6 µg/mL), porém em menor grau do que a combinaçäo niacina + tiamina (92,6 µg/mL). Considerando o seu menor custo em relaçäo à tiamina e à niacina, elegeu-se a triptona de caseína 3 por cento acrescida de 1 por cento de extrato de levedura para a produçäo de EEA, visando à purificaçäo. O trabalho atingiu o objetivo proposto e pode contribuir para incrementar a difusäo de método imunológico, com a possibilidade de atender ao controle de qualidade na condiçäo nacional.

Viabilidade e reduçäo de custo para purificaçäo de enterotoxina estafilocócica A destinado ao método de OSP / Viability and reduction of the cost of Staphylococcal Enterotoxin A purification for OSP methods

Purification of staphylococcal enterotoxin A (SEA) intended for use as reference toxin in Optimum Sensitivity Plate - OSP is described Staphylococcus aureus 722 was inoculated in 3,0 per cent tryptone plus 1,0 per cent yeast estract medium, and submitted to the shake flasks or sac culture procedure. SEA produced in the supernatant was captured through adsortion with Amberlite CG-50 and after elution, concentrated by dialysis against polyethileneglycol 15000 to 20000. The recovery of 56mg (37 per cent( and 15mg (11 per cent) respectively from resin treated sac culture and shake flask supernatant suggested that in the second method, other metabolities from staphylococcal growth competed wish SEA and caused undesirable resin saturation. The SEA at this level of purity was adequate for OSP purpose, with advantage in reducing costs and making it avaiable at routine laboratory of national condition

Detecçäo de termonuclease de estafilocócica em leite através de método rápido e barato / A rapid and low cost adaptation of staphylococal tnase detection in milk

Resumo: Um método visndo detecçäo direta de termonuclease (TNase) em leite foi desenvolvido, coma finalidade de triagem de alimentos contaminados com estafilococos enterotoxigênicos. A substituiçäo de soroalbumina bovina (BSA) do tampäo tris por proteose peptona número 3 concedeu melhor proteçäo à TNase em caldo BHI e leite ontaminado com estafilococos enterotoxigênicos, embora seja inferior ao método de preciptaçäo com tricloroacético seguida de centrifugaçäo. estas modificaçöes poderäo ser úteis em condiçöes onde existem dificuldades referentes à disponibilidade de BSA e centrifugaçäo a alta rotaçäo para detecçäo direta de TNase estafilocócica em alimentos (au)